Dopo le guerre, le oppressioni, gli scismi, le discordie politiche e la diminuita disciplina, oltre alla non più necessaria funzione assistenziale dovuta all’esiguo numero di pellegrini che percorrevano la via romea, l’ospedale di Altopascio cessò definitivamente la sua attività il 28 gennaio 1587, anno in cui il papa Sisto V con una bolla disponeva la soppressione dell’Ordine dei Frati di Altopascio, mentre Ferdinando I° dei Medici assegnava le rendite all’Ordine Cavalleresco di S. Stefano, istituito a Pisa da Cosimo I° (1561).